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从层析荧光到微流控生物芯片 —POCT技术基础概述

概要

场快速检验(Point-of-Care Test, POCT),也称即时检验,国际上通称的POCT,是体外诊断行业增长最快的领域。被广泛使用的血糖仪即为最成功的POCT产品,占有整个POCT市场60%以上的份额[1]。

文章来源:《中国医疗器械信息》

作者简介:单万水,教授,主任技师。广东省临床重点专科检验科主任,深圳市第三人民医院院士工作站主任,深圳市医学会检验专委会副主任委员,深圳市医师协会检验分会副会长。

内容提要文章对目前现场快速检验Point-of-Care Testing,POCT)市场上的各种主流技术进行概述,集中讨论POCT市场占比最大的技术平台免疫层析技术,根据其工作原理和制造过程,从基本的物理、化学原理出发讨论影响检测结果的主要因素,并从生产、应用层面探讨实现可靠检测的关键手段,进而针对目前精准医疗、个性化医疗的市场需求探讨POCT技术的发展方向和最新出现的技术平台基于生物芯片的微流控技术,最后就POCT市场上的现有及未来技术平台进行综合分析。


现场快速检验(Point-of-Care Test, POCT),也称即时检验,国际上通称的POCT,是体外诊断行业增长最快的领域。被广泛使用的血糖仪即为最成功的POCT产品,占有整个POCT市场60%以上的份额[1]。目前市场上最有代表性的两种便携式POCT技术是胶体金(或荧光)免疫层析技术和荧光免疫毛细技术。前一种以多家中国公司的产品为代表,后一种以美国Alere公司的Triage产品系列为代表。免疫层析技术起始于上世纪80年代初,而Triage产品的开发始于上世纪90年代,都已有了二三十年的历史[2]。近两年来,中国、美国等世界上主要国家都在大力推行精准医疗、并已把精准医疗定位为长期战略发展方向。精准医疗首先需要精准诊断,这就对医疗检测仪器的性能提出了全新的要求。在此大背景下,两项关键技术在医疗检测行业迅速发展,一个是生物芯片技术,另一个是微流控技术。理邦m16磁敏免疫分析系统(生产单位:深圳市理邦精密仪器股份有限公司,简称理邦)是其中一个具有代表性的产品。它把微阵列生物芯片集成进了微流体器件里面。其生物芯片是一个多层纳米膜结构的微阵列、是通过大规模集成电路工艺制造的。相对于传统意义上以玻璃片为基底、以荧光材料为标记物的基因芯片,m16上的生物芯片是在单晶硅片上实现的、通过量子力学现象传感的技术。其微流控技术依赖于机械机构对被测样本和测试试剂实现精确控制。本文对层析荧光技术、毛细荧光技术和微流控生物芯片技术进行详细分析,对3个平台的技术特点进行讨论,并对它们的发展方向和应用进行探索。

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免疫层析技术

1.1技术原理

图1所示的是胶体金免疫层析测试卡的结构,由样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫构成。其中,胶体金颗粒上修饰有检测抗体,硝酸纤维素膜上有检测线和控制线。检测时,被测样本在毛细作用下通过胶体金标记的抗体,形成抗原抗体胶体金复合物,复合物继续爬行,通过包被有捕捉抗体的检测线,形成双抗体夹心胶体金复合物,在检测线处呈现色带。过量的胶体金抗体流过检测线,在之后的控制线上形成胶体金免疫复合物,呈现色带。需要注意的是,控制线上色带的形成与被检测物质的存在与否无关,即使样本里没有被检测的物质,控制线也会显现。这种“捕捉抗体-抗原-检测抗体-胶体金纳米颗粒标记物”复合结构被称为双抗体夹心结构,胶体金为指示标记。最典型的产品是“早早孕”试纸条,采用双抗体夹心一步法技术,以胶体金为指示标记检测尿液中的人绒毛膜促性腺激素(Human Choionic Gonadotophin,HCG)浓度,以判断受检者是否受孕。

图1 免疫层析技术原理

检测线上的信号强度也即测试结果可以由公式(1)计算[3]

其中k是一个和抗体-抗原之间亲和力有关的常数,t是样本在反应区的驻留时间,Ab是检测线上捕捉抗体的浓度,Ag是被测样本中被测物质的浓度。

常数k也和反应条件如pH值、温度等有关系。从化学反应的角度来看,温度从25℃降低到15℃,反应速度降低50%。抗体抗原反应的最佳温度是37℃,一般1~2h就可以达到峰值。如果在4℃反应,达到峰值时间会长达12~24h。所以检测过程应该尽量保持在同一个温度下进行,否则室内温度的变化会带来很大的影响。

当样本体积一定时,样本在反应区的驻留时间t和流速成反比。流速增加一倍,信号值就降低75%。样本的流动速度可以由公式(2)计算[4]


其中k是所用材料(这里主要指硝酸纤维素膜)的渗透率,

是和毛细作用有关的拉普拉斯压力,
是样本黏度,
是材料的孔隙度,x是位置。样本的黏度
是影响检测物流速的重要参数。黏度越大,流速越慢,被测物质就有更多的时间和捕捉抗体进行反应,结果就更明显。换言之,即使不同的样本中被测物质浓度相同,但是结果会和样本的黏稠度有关系,测试结果可能有很大不同。

公式(2)中另一个重要参数是x,也就是检测线的位置。x值越小,检测线离样品垫越近,流速也就越大,这样反应上的被测物质就越少。由此可见,检测线的位置是一个非常重要的设计参数,制造过程中需要严格的控制。值得注意的是,检测线的位置是相对于样品垫和胶体金结合垫来讲的,所以除了需要精密控制检测线在硝酸纤维素膜上的位置,对样品垫和胶体金结合垫尺寸和位置的控制同样重要。

如果样本量发生变化,则公式(1)中的驻留时间t也会发生变化。尤其是当样本量太少时,样本很快的流出反应区,被测物质没有足够的时间和捕捉抗体进行反应、结合,导至测试结果低于正常期望值。当样本量过多时,吸水垫可以起到一定的调节作用,饱和以后可以有效阻挡样本的继续流动。但是,驻留在检测线上没有流走的被检测物还会继续和捕捉抗体反应,直到结合过程和分解过程达到一个平衡。但是,这个平衡是和其他条件如温度有关系的。在这种情况下,严格的控制检测时间和环境温度就变得非常重要。

1.2材料和制造过程对检测性能的影响

图1所示的免疫层析器件看似非常简单,但实际上却是一个非常复杂的结构,影响其检测结果稳定性和重复性的因素众多,这也是多年来此项技术只用在定性判定上的原因。技术储备雄厚的公司已经有了定量检测产品,但是批间差、卡间差仍是一个大的挑战。如果用S表示检测结果信号强度,S可以用表达式(3)描述:

表达式(3)S=f [Y(样品垫),J(胶体金垫), Jj(胶体金颗粒),X(硝酸纤维素膜), Ab(抗体), M(制造过程)]    

即最后的信号强度受样品垫、胶体金垫、胶体金颗粒、硝酸纤维素膜、抗体、以及制造过程的影响。而以上列举的每一项变量又受多个因素的影响。举例来讲,影响样品垫特性的因素可以由表达式(4)描述:

表达式(4):Y(样品垫) =f(材料,蛋白质,缓冲剂,洗涤液,表面活性剂,黏度调节剂,制造过程)

表达式(4)中的材料可以是纤维素膜,也可以是网状织物,但它们有很大差别。举例来讲,网状织物可以较薄、机械强度较好、耐拉、存留体积(可保留液体体积)小,但是确难以在上面加足够量的化学试剂来调节样本中的蛋白成分、pH值、离子强度、黏稠度等,也就是说表达式(4)右侧中的第2、3、4、5、6项的调节就比较困难。纤维素滤膜的特点和网状织物几乎完全相反:较厚、存留体积大、强度小、很难操作。因为存留体积大,所以有足够的空间来在上面修饰各种化学试剂。组装对纤维素滤膜是一个关键的因素,必须确保和胶体金颗粒垫有良好、一致的接触,否则会严重影响被测样本向前流动,这就是表达式(4)右侧第七项(制造过程)所涉及的内容。

表达式(4)中的第二项(蛋白质)的主要作用是封闭样品垫、防止样本中的被测物质因为非特异吸附力而被吸附在样品垫上、不能被检测线检测。另外,如果样品垫上封闭蛋白的量和配比合适的话,硝酸纤维素膜就可以不必再封闭,使成本和操作复杂性大大降低。同一个测试卡产品可能被用来测试多种不同的样本,例如血清、血浆、全血、甚至尿液,缓冲液可以被用来调节样本的pH值,在一定程度上使不同样本中的同种被测物质在检测线上的反应性保持一致。举例来讲,尿液的pH值可以在5~10的大范围内变化,同样浓度的被测物质在不同的pH值环境下的反应性会有很大不同,缓冲试剂可以比较有效的降低这种变化。

表达式(4)中右侧第六项(黏度调节剂)的作用非常重要。由公式(2)可知,样本的黏度对样本流动的速度有直接影响,而由表达式(1)又可以看出样本流动的速度对检测结果的影响又进一步放大。所以,控制样本的黏度非常关键。黏度调节剂的作用是调节不同样本的黏度,使它们在硝酸纤维素膜上流动的速度尽可能相同。

硝酸纤维素膜是使用者可以观察到的另一个部件,也是免疫层析器件上最重要的一个部分。影响它性能的因素可以由表达式(5)描述:

表达式(5):X(硝酸纤维素膜)=f(最大孔隙尺寸,孔隙尺寸分布,孔隙占比,封闭剂,缓冲液,表面活性剂)         

硝酸纤维素膜最重要的性能参数是试剂在其中的流速,这主要由表达式(5)中右侧的前3项决定。在最大孔隙尺寸以及孔隙尺寸分布相同的前提下,流速和孔隙占比大约成正比关系。这里面最大的挑战是用宏观的过程控制微观的关键参数。硝酸纤维素膜一般是成卷生产的,卷的宽度是几十厘米,每一卷材的长度是100m。生产过程需要把这样大面积的原材料切割成大约为4mm×40mm的测试条的尺寸,同时保证每个条之间的一致性。此外,测试条边沿需要保持直线形状、测试条表面不能被接触或污染。这样一个生产过程所造成的结果是,同一大张“纸”上切割出来的测试卡的一致性会比较好,但是,控制批间差就要困难很多。

1.3质量控制

图2所示是免疫层析产品的生产过程。首先在大张层析膜上喷画控制线和检测线,然后把此大张层析膜粘贴在支撑底衬上。这个过程必须要确保底衬和膜的接触紧密、均匀一直,否则将会导至不同测试条(卡)之间的液体流动速度和方式有很大的不同。下一步是粘贴胶体金垫、样品垫和吸水垫。吸水垫和胶体金垫各自和硝酸纤维膜有部分交叠,样品垫覆盖了胶体金垫的一部分。这里面最需要注意的是各层之间的交叠、接触需要密切、均匀,不能在任何膜层表面引入物理变形、污染物、或者化学杂质。很多和液体流动均匀性有关的问题都和以上这几个过程有关。最后一步是在温度和湿度都受控的房间里,把上面制作的大张材料切割成一条条的试纸条,组装入塑料壳。


图2 免疫层析产品的制造过程

从上面的制造过程可以看出,同一大张材料上切割出来的测试卡的一致性会比较好,因为是在同一个时间、同一个环境条件、用同一片材料、同一次制作过程完成的。比较难以控制的是不同批次间的差别。所以质量控制也应该主要关注批间差。

建议质量控制流程如下:

  1. 保留最少18个质量有保证的测试卡。

  2. 准备最少两个浓度的样本,一个是在cut-off值附近,另一个是中值。

  3. 如果有检测全血、血清、血浆等不同样本的需求,则需要按照2来准备不同的样本。

  4. 每个浓度点测试3个卡,计算平均值。

  5. 如果平均值相差超过10%,则新批次测试卡不合格。

  6. 如果使用温度和室温(25℃)相差较大,则需要和室温结果比对。

以上第二项考虑的是,如果测试卡存在问题,那问题在cut-off值附近会被放大。第三项的考虑是不同的样本黏稠度不同,对胶体金垫上颗粒的稀释能力会不同,在硝酸纤维膜里的流动速度会有差别。而从前面的讨论我们知道,样本在膜中的流动速度是对测试结果影响最大的因素之一。第四点、第五点考虑的原因是,免疫检测不可能100%完全重复,需要平均并给与一定的误差量。

值得一提的是,胶体金免疫层析、荧光免疫层析、上转发光免疫层析这三种产品都是建立在“层析”这个技术平台上,所以以上的讨论对三种技术均适用。但是,荧光的使用使检测灵敏度得到了一定程度的提升。荧光免疫层析的一个很大的问题是散射的入射光对检测信号的干扰,而使用上转发光可以有效地消除这个问题。

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微流体技术

从上面的讨论我们可以知道,层析检测技术是一项看起来很简单、但是实际上很复杂的技术。里面最少有4种薄膜、两种抗体、抗体修饰的胶体金颗粒、缓冲液、封闭液等。制造过程最难把控的因素来源于:①把各种生化试剂载入相应的材料中并进行干燥;②把各种材料完美、重复的组装在一起。任何存在于各层材料之间的界面缺陷和界面不重复性都会直接导至检测结果的重复性变差甚至失败。解决这些问题的一种办法就是摈弃层析这个平台。美国Alere公司qixia的Triage产品系列就是采取了这样一种方略。

图3 Biosite微流体测试卡结构

图3所示是美国Alere公司qixia的Triage产品系列的测试卡结构,其中没有任何的薄膜材料。它有上下两层材料组成,两层材料之间的距离是可以产生毛细现象的距离。上层为高度透明材料,目的是可以使在两层材料之间产生的荧光信号不受干扰地传播到透明材料另一侧的荧光检测器件上。底层表面的地貌随需求变化而不同,而最突出的特征就是“搓衣板”地貌。这样一个“搓衣板”地貌可以有效的增加表面积、增加抗体固定量及固定强度。在测试区域的表面上修饰的主要是捕捉抗体和封闭试剂,在样本准备区域的不同部位上修饰有荧光标记物、检测抗体、缓冲试剂、封闭试剂等。样本进入测试卡以后,其中液体溶解各种生化试剂,毛细作用推动试剂向检测区流动。

把一根细细的玻璃管的一端垂直放进一个水盘子里,水在玻璃管里面就会因毛细作用而上升,上升的高度可以由Jurin定律来计算[4]


其中

是液体-空气表面张力,
是液体和玻璃管表面的接触角度,