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“分子诊断万花筒”—经验篇:如何应对等温扩增时出现的假阳性问题

概要

摘要: 导主按等温扩增技术作为一种核酸分子诊断技术,从诞生之日起就不断受到研究者的青睐,但也少不了唏嘘、质疑,甚至摒弃。引起这种截然相反的态度的原因在于等温扩增技术自身所存在的缺陷。而最为突出的一点是,在建立 ...

导主按

等温扩增技术作为一种核酸分子诊断技术,从诞生之日起就不断受到研究者的青睐,但也少不了唏嘘、质疑,甚至摒弃。引起这种截然相反的态度的原因在于等温扩增技术自身所存在的缺陷。而最为突出的一点是,在建立方法或者实际样本检测的过程中,等温扩增技术引起假阳性结果的概率相对较高,使得其实际应用范围变窄,未能真正显示出其检测优势。因此,隆地熊推出经验篇来回答“当等温扩增出现假阳性时我该怎么办?”。 需要声明的是,本篇所说“假阳性扩增”特指“没有DNA模板、只含引物的扩增体系所引发的假阳性扩增结果”。对于非目标DNA模板所引起的假阳性扩增,往往是由于引物序列不保守引起的,重新设计引物会使该问题得到解决。


为了解决假阳性问题,首先得明白构成等温扩增反应体系的具体组成成分。以环介导等温扩增(LAMP)为例,反应体系所含成分主要有:商业化Bst DNA聚合酶、商业化等温扩增缓冲液、硫酸镁、甜菜碱、dNTPs、引物、DNA染料(SYBR Green I等)或者离子指示剂(钙黄绿素-锰离子和羟基萘酚蓝等)。为什么要以LAMP为例,因为其只需一种生物酶,体系构成相对来说简单,且反应温度能够使生物酶发挥最大功效。而对于多酶介导的等温扩增技术,如切口酶介导的链置换扩增,反应体系往往是顾此失彼的,即所建立的反应体系或者反应温度虽然适合切口酶发挥最大功效,但不适合于Bst DNA聚合酶的高效工作。当生物酶未能发挥最大功效时,其生物活性就会引起负面效果,如限制性内切酶的星号活性引起非特异性切割、聚合酶引起dNTP不保真聚合、碱基错配延伸概率增高等问题。因此,在建立多酶等温扩增技术时,假阳性扩增是无法避免的,且出现的时间要明显快于单酶等温扩增技术。为了解决多酶等温扩增技术的假阳性问题,针对目标序列设计特异性荧光标记探针成为上上之策。需要提醒的一点是,虽然通过优化反应体系成分能起到一定的解决效果,但多酶等温扩增的假阳性不稳定,在反复测试时会变得更快,优化后的反应体系难以遏制这种现象的出现。所以,针对多酶等温扩增时引起的假阳性扩增,此文暂且不表。本篇着重讲讲如何应对单酶等温扩增引起的假阳性问题。


1、端正心态,坚持不懈地探索。对于一个新手或者首次接触等温扩增的研究者来说,假阳性结果的出现,就如同五雷轰顶,万念俱灰。各种各样的心绪开始萌生:完不成实验?发不了文章?毕不了业?等等。时间来得及的话你可以选择放弃等温扩增,重新换课题。反之,你必须端正你的态度,以探索科学的心态来应对假阳性,坚持不懈,不断尝试。有了探索的心态就是成功的一大半。


2、试剂分装,节约成本。这点是针对条件不好的实验室或机构而言的。出现假阳性扩增时,除了研究者本身情绪的波动,还会引起试剂污染,资金浪费。因此,为了节约成本,强烈建议试剂分装,尤其是dNTPs、引物液和聚合酶的分装。分装时建议在一个从未进行过等温扩增的洁净室内完成(注意器械的消毒和无核酸酶处理)。当出现假阳性时,我们可以通过更换试剂的方法来查找导至j假阳性结果的体系成分。一般经验是,聚合酶、充当空白模版的水和引物是主要罪魁祸首。若只需更换试剂,就避免了假阳性结果。那恭喜你,你可以准备后续测试了。实际情况却是“你想得美”。


3、关注引物的质量。如果是引物质量引起的假阳性。解决的对策有:(1)提高纯化级别至HPLC,以排除引物干粉惨杂物对体系的影响;(2)选择质量过硬的合成机构;(3)严格遵循引物保存的条件:干粉和高浓度引物液-20℃可保存数月;非干粉和工作浓度引物液4℃保存不超过一周。


4、关注dNTPs的质量。dNTPs建议分装保存在-20℃。低质量的dNTPs不仅导至阳性扩增效率下降,还能引起非特异性扩增,即假阳性结果。LAMP中所用dNTPs量要大于PCR的用量,以供高效循环扩增所需原料。当其质量下降时,循环扩增未能占优势,会使副扩增——假阳性扩增抬头。


5、关注Bst DNA聚合酶的选择和质量。在所有成分中,聚合酶是最不可控的因素。如果你所在实验室或机构具备合成酶的能力,就另当别论。一般人都是购买商业化的Bst DNA聚合酶,其中以NEB公司市场占有率最高。目前,NEB公司已经推出Bst DNA聚合酶(大片段)、Bst DNA聚合酶2.0、热启动型Bst DNA聚合酶2.0和Bst DNA聚合酶3.0。要想假阳性扩增发生概率少,建议选择热启动型Bst DNA聚合酶2.0。聚合酶的质量主要受酶保存液、温度等影响。因此,如果在运输过程中没有低温保存、保存液在管壁周围粘附,就毅然决定拒收聚合酶,因为酶质量肯定受影响,易引起假阳性。酶的保存条件推荐为-20℃分装保存。


6、优化反应体系,尤其关注dNTPs量、甜菜碱浓度、硫酸镁浓度、引物比例和聚合酶量。对于单酶等温扩增技术而言,优化反应体系是解决假阳性扩增最为直接、有效的方法。当然,在进行体系优化前,要保证所有体系成分都不会引起假阳性。换言之,要确认好是反应体系配方引起的假阳性。


7、引物设计要过关。以LAMP为例,一对高效的引物绝不是简单地依据引物在线设计平台所作评估就可以得到的。重点关注内引物FIP和BIP的设计,建议联合使用在线设计平台和Oligo 7软件来评判:(1)排除二聚体形成。引物之间二聚体容易导至假阳性,故设计引物首先得避免高自由能的二聚体形成;(2)要关注引物5'端和3'端序列,不能有很连续三个或三个以上的碱基匹配;(3)引物自身不能有很强的二级结构形成。针对FIP和BIP,其5'端用于回旋杂交的部分其退火温度要介于60~65℃之间。特别要说明的是,真正高效引物都是通过具体实验挑选出来的,以阳性反应速度、假阳性有无或假阳性速度、灵敏度(主要测试百倍梯度稀释的高、中、低三个浓度)作为评价指标。


8、样本成分耐受性影响。在建立等温扩增技术时我们往往会忽略实际样本成分给扩增带来的影响。由于实际样本绝非是纯的核酸样本,纵使用最好的纯化试剂盒,部分样本成分仍然会出现在最终提取液中。这些样本成分包括尿素、尿酸、血清、血清、胆汁酸等,在等温扩增时会使阳性反应速率变慢,诱发假阳性扩增或假阴性结果。因此,一个好的检测试剂盒,必须对一定量的样本成分有很好的耐受性。强烈推荐,在方法构建好之后,必须进行实际样本检测或者模拟实际样本检测等实验。


9、关注个人操作的标准性。实施分子诊断时,操作者必须遵循规范操作,因为气溶胶(阳性扩增产物在气体介质中形成的胶体分散微小体系)在整个操作过程中均有可能形成,尤其是添加待扩增模板分子时。因此,配制反应体系(不含模板)、添加模板、扩增、检测四个步骤要严格分区,手套和实验室每个分区专门配置(严禁套穿)。要明确的是,实验者本身也是污染源的传播媒介。针对扩增和检测一体化模式,虽然闭管反应能降低污染,但鉴于反应管质量问题,推荐扩增完在其他区域进行结果判断。另外,扩增仪器建议要定期消毒清洁并做无核酸酶处理。


10、反应后扩增液的合理保存和处理。阳性气溶胶往往来自反应后的扩增液。如果不能很好的保存或处理这些扩增废液,整个实验室就会充满这个阳性气溶胶。此时无论使用何种措施都无法消除假阳性结果的“死神”般存在。虽然有文献报道可以引入dUTP和UDG酶等反制措施,但是这种反制措施的成本高,不适合推广。后续实验如果需要这些废液,建议至少双重密封套密封扩增废液,并置于-80℃集中保存;若废液无任何价值,仍建议至少双重密封套密封扩增废液,并立即作为生化废液移出实验室处理。


导主再按

以上十点建议并非是解决假阳性问题的万能钥匙,仅为隆地熊的个人经验。相信其他从事等温扩增研究的人也都有其解决假阳性问题的经验与方法。彼此经验共享对于等温扩增研究领域的健康发展是至关重要的。如果你恰巧有这方面的经验,不妨告知“分子诊断万花筒”,我们会将这份经验共享于大家,让彼此少走弯路。