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PCR技术盘点

概要

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:模板DNA的变性,模板DNA与引物的退火(复性),引物的延伸。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:模板DNA的变性,模板DNA与引物的退火(复性),引物的延伸。重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。反向PCR(inverse-PCR)反向PCR(inverse-PCR)是克隆插入片段侧翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假阳性太多,而Inverse-PCR一般只要有特异条带,基本上就是目的片段。

直接原位PCR

原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术,使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞(爬片、甩片或涂片)或组织(石蜡、冰冻切片)上直接对靶基因片段进行扩增,通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。

间接原位PCR(原位杂交PCR)

与直接原位PCR所不同的是,靶基因在扩增时不进行标记基团的掺入,而是标记一段与扩增片段互补的探针,在扩增结束后,应用此探针进行原位杂交。因此,此处主要介绍原位杂交,其余方法同原位PCR。

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。

实时荧光定量PCR(realtime PCR)

所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。重叠延伸PCR重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOEPCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。

甲基化PCR甲基化特异性聚合酶链反应(MSPCR)

其作用原理基于DNA经亚硫酸氢钠处理后,来自父方非甲基化序列的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而来自母方甲基化序列则保持不变,随后用具有高度特异性的引物进行扩增。

降落PCR

降落PCR(touchdown PCR),一种PCR技术,主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行,例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低,但退火温度过低则会使非特异扩增过多。差示反转录PCR实验差示反转录PCR也称为mRNA差异显示技术,它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术,简便、灵敏、RNA用量少、效率高、可同时检测两种或两种以上经不同处理或处于不同发育阶段的样品,该方法自问世以来被广泛用于差异表达基因的克隆鉴定研究中。

第三代PCR技术

第一代PCR就是常见的定性PCR技术,它采用普通PCR仪来对靶基因进行扩增,采用琼脂糖凝胶电泳来对产物进行分析。第二代PCR就是荧光定量PCR技术(Real-Time PCR,qPCR),它通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测扩增产物的积累,借助荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。

第三代PCR技术--数字PCR(Digital PCR,dPCR,Dig-PCR),是一种全新的对核酸进行检测和定量的方法。它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标,即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。

PCR芯片技术PCR仪器发展的趋势之一变得更加微型化,PCR芯片就是在这种趋势下诞生的。PCR芯片就是在微型的载体上进行PCR反应,是微型化的PCR仪。芯片PCR不仅节省了大量反应试剂因此降低了实验成本,还有助于提高反应速度。