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【抗体】——如何做出漂亮WB图片

概要

WB(Western Blot)实验是定性、定量检测蛋白表达的一种经典、有效的技术方法。WB的优点是灵敏,可达ng级别,用ECL显色法可达pg级别,方便,特异性高

WB(Western Blot)实验是定性、定量检测蛋白表达的一种经典、有效的技术方法。WB的优点是灵敏,可达ng级别,用ECL显色法可达pg级别,方便,特异性高,但是WB实验步骤繁多,操作复杂,许多朋友在做WB实验时吐槽总会遇上这样那样的问题:WB检测信号弱、检测不到条带、有非特异条带、背景深等等,导致无法获得想要的WB图片。对此:预防为主,严格按要求做好每一步。下面根据我们实验的经验为大家整理了常见的WB实验问题以及相应处理方法,希望能帮助大家获得想要的漂亮WB图片结果,如有补充,欢迎留言。

01 无条带

1.  抗体不够。抗体对目标蛋白的亲和力可能较低或活性降低,建议增加抗体浓度(比建议的起始浓度高2-4倍)。也可能是抗体失去活性,需要换新的抗体。

2.  样本中蛋白含量低。建议使用阳性对照样本确定实验的有效性,提高蛋白上样量,用其他方法确定样本中目的蛋白的存在。

3.  转膜失败。确保NC或者PVDF膜与凝胶之间有良好的接触。

4.  转膜不完全。建议优化转膜时间,高分子量蛋白需要更长时间。为了保证转膜完全,建议用丽春红,酰氨黑,印度墨水染膜。或使用预染marker。

5.  转膜转过了。降低低分子量蛋白质(< 10 kDa)的转移电压或时间。

6.  蛋白等电点大于9。建议使用pH值较高的替代缓冲系统,如CAPS (pH 10.5)。

7.  二抗使用错误。确认二抗的宿主和亚型。

8.  抗体过期。建议更换新鲜抗体。

9.  抗体储存不当。按照供应商建议储存,避免反复冻融。

10.叠氮化钠污染。确保缓冲液不含叠氮化钠,因为叠氮化钠会抑制HRP信号。

11.抗体孵育时间不够。建议4℃过夜孵育一抗。

02 条带弱

1.  蛋白和抗体结合较弱。建议减少洗涤次数,降低抗体稀释液和洗液中的NaCl浓度(推荐范围为0.15M - 0.5M)。

2.  抗体不够。抗体对目标蛋白的亲和力可能较低或活性降低,建议增加抗体浓度(比建议的起始浓度高2-4倍)

3.  蛋白量不够。建议提高样本上样量。

4.  偶联物活性降低。建议把酶和底物在一个管子中混合,如果没有显色或者很弱,需要更换新的试剂做实验。

5.  ECL试剂失效,建议更换新的ECL试剂。

6.  脱脂奶粉可能会封闭一部分抗原。建议降低封闭液和抗体稀释液中奶粉的含量或者用3%BSA代替。

03 多条带

1.  一抗的非特异结合。建议降低一抗浓度,减少蛋白上样量,或者更换特异性更高的单抗。

2.  二抗的非特异结合。不加一抗,仅用二抗做对照,如果出现条带就选择其他二抗。

3.  一抗或二抗的非特异结合。建议在一抗或二抗溶液中加入0.1 - 0.5% Tween20,提高洗液Tween20含量(0.1%-0.5%),增加洗膜次数,提高抗体稀释液和洗液中的NaCl浓度(0.15M - 0.5M)。

4.  蛋白的聚集。建议增加DTT用量(20 -100mM DTT),保证二硫键完全还原。上样前在沸水中加热5-10分钟,并进行短暂的离心。

5.  蛋白的降解。建议避免样本的反复冻融,样本储存前加入蛋白酶抑制剂或者使用新鲜样本。

6.  试剂污染。检查缓冲液中是否有微粒或细菌污染,使用新鲜的试剂。

04 高背景

1.  一抗的非特异结合。建议降低一抗浓度,用5%优质脱脂牛奶封闭,调整一抗溶液中脱脂奶粉含量(2%-5%)或者NaCl浓度(0.15M - 0.5M),或者更换特异性更高的单抗。

2.  二抗的非特异结合。不加一抗,仅用二抗做对照,如果出现条带就选择其他二抗。

3.  封闭不完全。在含有5%脱脂奶粉的封闭液中加入0.1%- 0.5% Tween 20,适当延长封闭时间。4℃封闭过夜可能降低封闭效果。

4.  脱脂奶粉可能会封闭一部分抗原。建议用3%BSA代替。

5.  脱脂奶粉含有内源性生物素,与亲和素/链霉亲和素不相容。建议用3%BSA代替。

6.  一些抗体可以识别牛奶蛋白。建议用3%BSA代替。

7.  洗膜不充分。建议增加洗涤次数,提高洗液Tween20含量(0.1%-0.5%)。

8.  胶片曝光过度。建议降低曝光时间,如果目标信号太强,等待5-10分钟,重新曝光到胶片上。

05 白色条带

  1. 过度的信号生成。建议降低抗体或蛋白浓度,过量的抗体或蛋白可引起极高水平的局部信号(通常是一条带)。这导致在这一点上底物的快速、完全消耗,由于这个反应完成后没有光产生,所以当暴露在胶片上时,就会产生白色的条带。

  2. ECL显色剂过于灵敏,或者发光时间太短。建议更换低灵敏度的ECL显色剂。


06 出现斑驳不平的斑点

1.  试剂的污染。检查缓冲液中是否有微粒或细菌污染,使用新鲜的试剂。

2.  孵育或洗涤的溶液不够。确保膜完全浸泡到洗液或孵育液中。

3.  在膜中有气泡。轻轻去除所有气泡。特别是在转膜过程中。

4.  孵育过程中搅拌不均匀。通过放置在摇动器上确保搅拌均匀。

5.  设备污染。确保电泳装置正确清洗。残留的蛋白质或凝胶碎片可能会粘附在膜上,彻底洗膜。

6.  曝光过度。建议减少曝光时间。